Activación de Genes Silenciosos Productores de Metabolitos Secundarios en Streptomyces, para la Obtención de Nuevos Antibióticos

Activation of Silent Secondary Metabolite Genes of Streptomyces to Obtain New Antibiotics

Valeria Alejandra Rodríguez Moreno1, Jesus A. Morlett Chavez2 y Nagamani Balagurusamy1*
1Laboratorio de Biorremediación de la Escuela de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Coahuila, Unidad Torreón. *Correo electrónico: bnagamani@uadec.edu.mx
2Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Coahuila, Unidad Saltillo.

 

Resumen

Los antibióticos, se han utilizado a lo largo de los años gracias a los beneficios que han traído consigo desde el área de la salud hasta la agricultura, sin embargo, uno de los problemas importantes en los últimos años es el incremento de la resistencia de antibióticos. Por tal motivo, la búsqueda para obtener nuevos compuestos antimicrobianos se ha convertido en una necesidad urgente. Debido a los avances de la biotecnología, se ha logrado obtener información del genoma de Streptomyces, resaltando su alto potencial para producir docenas de metabolitos secundarios entre ellos gran variedad de antibióticos, de los cuales, sólo una parte son producidos en condiciones estándar de fermentación. El uso de estrategias para estimular la expresión de los genes silenciosos involucrados en el metabolismo secundario de estos microorganismos, ha implementado el descubrimiento de nuevos antibióticos. La manipulación de las condiciones de fermentación, regulación de moléculas de señalización, ingeniería ribosómica, manipulación genética de los genes reguladores y co-cultivos, son algunos de los métodos que se presentan en este documento y que son utilizados para activar este tipo de genes silenciosos en Streptomyces con el fin de incrementar la producción de nuevos antibióticos.
Palabras clave: Antibióticos, Streptomyces, metabolismo secundario y genes silenciosos.

Abstract

Antibiotics are being extensively used because of their beneficial effects, from human health to agriculture. However, increasing resistance to antibiotics is one the most important problems being faced by human society, which makes imperative the search of novel antimicrobials compounds. Streptomyces genus is well known to produce a wide variety of secondary metabolites, including different types of antibiotics. Thanks to advances in biotechnology, the genome of these bacteria have been understood, which showed their high potential to produce dozens of secondary metabolites under standard conditions of fermentation.  The use of new strategies to activate silent genes involved in the secondary metabolism of Streptomyces has lead to the discovery of novel antibiotics. Modifying fermentation conditions, regulation of signal molecules, ribosome engineering, genetic manipulation of regulatory genes and co-cultures are some of the means employed to activate these silent genes in Streptomyces in order to increase the production of these novel antibiotics and the mechanisms involved in these strategies are presented.
Keywords: Antibiotics, Streptomyces, secondary metabolites and silent genes.

INTRODUCCIÓN
Desde el descubrimiento de la penicilina (1928), la invención y desarrollo de nuevos productos naturales como fármacos, específicamente antibióticos, ha traído consigo grandes beneficios a la humanidad en términos de salud, veterinaria y agricultura. Sin embargo, el uso inadecuado e incontrolado de los antibióticos ha provocado la resistencia a éstos por diferentes microorganismos patógenos. Por esta razón, existe la necesidad de descubrir, obtener y caracterizar, nuevos y potentes compuestos antimicrobianos que hagan frente a los microorganismos resistentes (Olano y col., 2014). En los últimos años, el género Streptomyces ha recibido atención por su capacidad para producir una amplia variedad de metabolitos secundarios con capacidad anti-microbiana y anti-fúngica. Sin embargo, la producción de metabolitos secundarios bajo condiciones estándares de fermentación, empleando Streptomyces como inóculo, es baja (Olano y col., 2014; Tezuka y Ohnishi, 2014). Cabe hacer mención que avances en biotecnología e ingeniería genética ofrecen la posibilidad de incrementar la expresión de genes y así aumentar la producción de metabolitos secundarios con interés biotecnológico. Por tal motivo, en el presente trabajo se describen algunas de las técnicas empleadas en la activación de genes silenciosos (genes que en condiciones normales de cultivo no son expresados), para la producción de nuevos antibióticos en Streptomyces, presentando también información esencial sobre estos microorganismos, haciendo énfasis en la biosíntesis de metabolitos secundarios.

Características generales de Streptomyces
Los Streptomyces pertenecen a la familia Actinobacteria, bacterias aerobias Gram-positivas. Estas bacterias desarrollan filamentos durante su crecimiento (Hwang y col., 2014). En los extremos de los filamentos, se forman esporas reproductivas asexuales; si estas esporas llegan a un sustrato adecuado, pueden formar nuevas colonias. Generalmente, estos organismos producen enzimas extracelulares que les ayudan a utilizar proteínas, almidón, celulosa y diversos compuestos orgánicos del suelo (Tortora y col., 2007). Los Streptomyces cuentan con un cromosoma lineal de aproximadamente 8 a 10 Mb, dependiendo de la especie que se trate (Bentley y col., 2002; Fan y col., 2011; Nah y col., 2013; Hwang y col., 2014), así como varios plásmidos de forma lineal y circular (Hwang y col., 2014). Una de las características principales del genoma de las especies de Streptomyces, es la presencia de clústers de genes que codifican enzimas que contribuyen a la producción de metabolitos secundarios como policétidos, lactamas, péptidos no ribosomales y terpenos (Hwang y col., 2014).

Cromosoma de Streptomyces
Bentley y col. (2002), reportaron la primera secuencia genómica de S. coelicolor. Posteriormente, por su interés industrial, se obtuvieron las secuencias de los genomas de Streptomyces avermitilis (Ikeda y col., 2003), Streptomyces griseus (Ohnishi y col., 2008), Streptomyces clavuligerus (Medema y col., 2010) y Streptomyces tsukubaensis (Barreiro y col., 2012). La información obtenida de los genomas permitió determinar que el cromosoma de S. coelicolor posee una región central de 6 Mb, en donde se localiza la mayor parte de los genes implicados en la biosíntesis de macromoléculas, así como de la división celular y el metabolismo primario. También, este cromosoma cuenta en cada uno de sus extremos con una región conocida como brazos terminales. En estos brazos del cromosoma se localizan genes implicados en la síntesis de enzimas hidrolíticas y el metabolismo secundario. Asimismo, los extremos del cromosoma están limitados por las secuencias repetidas e invertidas llamadas TIR (Figura 1), (Bentley y col., 2002).

Elementos extracromosomales de Streptomyces y su inestabilidad genética
Los elementos génicos extracromosomales de Streptomyces son plásmidos que pueden ser lineales e incluso circulares (Ventura y col., 2007). Tienen un tamaño de entre 10 kb y 1.8 Mb, generalmente presentan genes del metabolismo secundario o no esenciales: por ejemplo el plásmido SCP1 de S. coelicolor contiene genes que codifican para la biosíntesis y resistencia de metilenomicina (Ventura y col., 2007) o el plásmido pSCL4 de S. clavuligerus, donde existen agrupaciones para la síntesis de varios metabolitos secundarios incluyendo diferentes antibióticos (Medema y col., 2010).

Además, Streptomyces y otras actinobacterias, contienen un gran número de transposones y elementos con características intermedias entre plásmidos y bacteriófagos denominados AICEs, por sus siglas en inglés (elementos integrativos específicos de sitio). Los AICEs actúan como moduladores del genoma hospedador y participan en la adquisición de agrupaciones génicas de metabolitos secundarios y otros ADNs por medio de transferencia genética horizontal (te Poele y col., 2008).

Otro rasgo importante de Streptomyces es la inestabilidad de sus cromosomas, ya que frecuentemente (0.1-1%) sus extremos presentan amplificaciones o deleciones espontáneas que suelen dar lugar a la circulación del cromosoma. Dichas mutaciones alteran principalmente al metabolismo secundario y la diferenciación celular (Chen y col., 2002). Un ejemplo muy común de la inestabilidad genética, es la versatilidad en la producción industrial de antibióticos mediante distintos clones en una cepa de  Streptomyces. La interacción entre el cromosoma y los plásmidos lineales, aunado a la inestabilidad genética de estos microorganismos, da lugar a la diversidad de agrupaciones de genes del metabolismo secundario, explicando la variedad de polimorfismos presentes en los extremos del cromosoma de diferentes especies de este género.

Streptomyces y metabolitos secundarios
Los metabolitos secundarios son moléculas poco o nada esenciales para el organismo que lo produce, siendo específicos en cada cepa y carecen de actividad dentro de las funciones de crecimiento celular (Evangelista-Martínez y Moreno-Enríquez, 2007). Debido a sus estructuras químicas presentan diferentes actividades biológicas. Este tipo de compuestos son sintetizados al entrar a la fase estacionaria del crecimiento celular (Mingyar y col., 2014) y están regulados por operones (Schaechter, 2009). Se estima que cerca de 23,000 metabolitos secundarios bioactivos son producidos por microorganismos y solo 150 se han usado en áreas como farmacología, agricultura, entre otras. Específicamente, más de 10,000 de ese tipo de compuestos son producidos por actinomicetos, mientras que alrededor de 7,600 compuestos son producidos por especies de Streptomyces (Olano y col., 2008).

 

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Figura 1. Representación circular del cromosoma de Streptomyces coelicolor. El circulo 1 representa la región central o núcleo (azul oscuro) y los brazos terminares (azul claro) del cromosoma, el origen de la replicación (Ori) y las proteínas terminales al extremo. Los círculos 2 y 3 muestran todos los genes, iluminados según su función (negro: metabolismo energético, rojo: transferencia de información y metabolismo secundario, amarillo: metabolismo primario, verde: funciones desconocidas, azul claro: reguladores). El círculo 4 indica genes implicados en procesos esenciales como replicación del ADN, transcripción, traducción, división celular. El circulo 5 indica en rojo los genes del metabolismo secundario; en azul, exoenzimas; en verde, proteínas de vesícula de gas; en azul, conservones. Los genes adquiridos por transferencia horizontal (anaranjado) y transposones (café), son mostrados en el círculo 6. En el círculo 7 se muestra el contenido en G+C y por último, el circulo 8 muestra el sesgo GC (valores menores a 1 en morado y valores mayores que 1 en café (Bentley y col., 2002).

 

Cuadro 1. Metabolitos secundarios producidos por Streptomyces.

 

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Los metabolitos secundarios de los estreptomicetos pueden clasificarse de acuerdo a su actividad biológica. En el Cuadro 1 se muestran diferentes metabolitos secundarios con su microorganismo productor respectivo y su función, comprendiendo: agentes antagonistas, como antibacterianos, antifúngicos y antivirales; agentes farmacológicos tales como antitumorales, inmunomodulares, agentes neuronales y enzimas inhibitorias; agrobiológicos, ya sea insecticidas, pesticidas y herbicidas y agentes morfogénicos (Tarkka y Hampp, 2008). De todos los metabolitos mencionados anteriormente son los antibióticos quienes han recibido mayor atención debido a su importancia en el campo de la salud.

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Figura 2.
Sitios de acción de los antibióticos con algunos ejemplos. Estos sitios se encuentran en diverso componentes bacterianos involucrados en actividades celulares vitales tales como la síntesis de la pared celular, síntesis de proteínas (ARN Polimerasa, proteínas ribosomales, ADN girasa), metabolismo del ácido fólico, estructura de la membrana, por mencionar algunos (Tafur y col., 2008).

Características de los antibióticos
Los antibióticos, son sustancias químicas producidas por un organismo vivo, los cuales tienen la capacidad para inhibir o eliminar el crecimiento o procesos vitales de otros microorganismos (Koolman y Röhm, 2004; Lorenzo y col., 2008). Existen antibióticos sintéticos (Koolman y Röhm, 2004) y semisintéticos, estos últimos producidos a partir de un antibiótico elaborado por el microorganismo, seguido de modificaciones químicas (Lorenzo y col., 2008). La variedad de estructuras químicas de los antibióticos agrupa varias clases de moléculas químicas orgánicas: cadenas alifáticas, anillos heterocíclicos, anillos aromáticos aislados o condensados, oligopéptidos y oligosacáridos entre otras. Los antibióticos se pueden clasificar: 1) según su efecto antimicrobiano: bacteriostáticos y bactericidas; 2) espectro de actividad: amplio espectro, espectro intermedio y  espectro reducido (Lorenzo y col., 2008); c) mecanismo de acción (Figura 2): antimicrobianos inhibidores de la síntesis de pared celular, inhibidores de la permeabilidad de la membrana plasmática, inhibidores de la síntesis proteica, inhibidores de la síntesis de ácidos nucleicos e inhibidores de las vías metabólicas y 4) por su estructura química  (Madigan y col., 2004; Lorenzo y col., 2008).

Genes implicados en la biosíntesis de antibióticos
El estudio de genes biosintéticos de antibióticos ha revelado la presencia de agrupaciones génicas que contienen genes estructurales relacionados con la síntesis del antibiótico y genes no estructurales. Los genes no estructurales están asociados con la regulación y resistencia, los cuales ayudan en la supervivencia del microorganismo productor del antibiótico (Bhattacharyya y Sen, 2004).

Los genes de resistencia se encargan de proteger a los microorganismos contra sus propios metabolitos. Para este fin las bacterias pueden realizar dos mecanismos diferentes, 1) modificación intracelular del antibiótico, llevado a cabo por enzimas hidrolíticas (β-lactamasas, acetiltransferasas, fototransferasas o glucosiltransferasas) (Hopwood, 2007b), 2) expulsión del antibiótico del citoplasma con ayuda de proteínas transmembranales que acoplan el transporte del antibiótico a un gradiente de protones o a la hidrólisis de ATP. Los genes reguladores, se encargan de codificar proteínas de bajo peso molecular con dominios de unión al ADN (Olano y col., 2008). Existen dos niveles de regulación para la producción de metabolitos secundarios. En el nivel superior o global, los reguladores pleiotrópicos se encargan de la regulación de la diferenciación morfológica y la síntesis de antibióticos, Por otro lado, en un nivel específico, los reguladores específicos de ruta controlan la producción de un único antibiótico cuya expresión depende de factores pleiotrópicos (Bibb, 2005).

Regulación de la síntesis de antibióticos en Streptomyces
La regulación y las señales de transducción para la producción de metabolitos secundarios en Streptomyces depende de los cambios del medio extracelular (Bibb, 2005; Liu y col., 2013; Hwang y col., 2014). La biosíntesis de estos compuestos inicia cuando la célula detecta escasez de nutrientes (glucosa, nitrógeno, fosfato) en el medio extracelular o moléculas específicas de señalización como γ-butirolactonas u otras (Liu y col., 2013; Hwang y col., 2014).

La reducción de la tasa de crecimiento, es una señal importante para la activación del metabolismo secundario. El papel de los nucleótidos de guanosina altamente fosforilados (ppGpp) en el desencadenamiento de la producción de antibióticos en Streptomyces, ha recibido una considerable atención debido a su participación en el control de la tasa de crecimiento y la expresión génica en estos microorganismos (Bibb, 2005). Se observa también que la ppGpp sintetasa asociada al ribosoma (RelA) es necesaria para la biosíntesis de antibióticos en condiciones limitantes de nitrógeno (Bibb, 2005). En este caso, las bacterias generan un sistema de regulación nutricional que provoca un descenso de la síntesis de ARN. Los ARNt se unen al sitio A del ribosoma generando la biosíntesis de ppGpp. Sin embargo, la manera en la cual actúa ppGpp para desencadenar el metabolismo secundario aún no ha sido señalado, posiblemente esté implicado en la selección de promotores de la ARN polimerasa (Hesketh y col., 2007).

A.    Reguladores pleiotrópicos
Los reguladores pleiotrópicos ejercen efecto en varias funciones celulares ya sea afectando la cascada de señales o restringiendo sus efectos al control del metabolismo secundario. Este tipo de reguladores tienen la capacidad de integrar una amplia diversidad de estímulos nutricionales, ambientales, tasa de crecimiento, señales intercelulares y, estrés fisiológico (Bibb, 2005). Dentro de los reguladores pleiotrópicos presentes en Streptomyces se encuentran: 1) sistemas de dos componentes (TCS), formados por una quinasa sensora (SK, Sensor Kinase) y un regulador de respuesta (RR, Response Regulator), los cuales controlan la expresión de ciertos genes como respuesta a factores del medio (Hoch, 2000); 2) sistemas de serina-treonina quinasas, siendo el sistema AfsK-AfsR-AfsS un ejemplo de ello, en donde se controla la biosíntesis de antibióticos y la diferenciación morfológica (Umeyama y col., 2002); 3) regulación por los genes bld, cuya inactivación detiene la formación del micelio aéreo e incapacita la síntesis de antibióticos (Chater y Chandra, 2006).

B.    Autorreguladores
Las γ-butirolactonas son producidas por casi todos los estreptomicetos y están implicadas en el inicio del metabolismo secundario en varias especies mediante la unión a receptores citoplasmáticos, actuando como señales intercelulares. La unión de estas moléculas con sus receptores actúa como activador transcripcional para la biosíntesis de antibióticos (Takano, 2006).

La γ-butirolactona más distinguida es A-factor (2-isocapriloil-3R-hidroximetil-γ-butirolactona) de S. griseus (Bibb, 2005). A-factor y sus derivados son autorreguladores que encienden el metabolismo secundario y la diferenciación morfológica o incluso ambos, con la capacidad de actuar a concentraciones de hasta 10-9 M (Bibb, 2005; Tezuka y Ohnishi, 2014).

A-factor es sintetizado por el intermediario de la ruta de la glucólisis, dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y por la proteína portadora de β-cetoacil-acil (ACP). La enzima clave en la biosíntesis de A-factor es afsA, la cual cataliza la condensación de DHAP y un derivado de ácido β-ceto. Como la transcripción de afsA es a lo largo del crecimiento, A-factor se acumula alcanzando un máximo de 100 nM a la mitad de la fase exponencial. Cuando la concentración de esta molécula alcanza niveles críticos, la expresión de varios genes con funciones requeridas en el metabolismo secundario y desarrollo morfológico se activa (Tezuka y Ohnishi, 2014).

Se sabe que en S. griseus, la unión de A-factor a su proteína de unión citoplasmática ArpA, libera esta última a partir del promotor adpA permitiendo su transcripción. AdpA, es necesario para la activación de la transcripción de strR, el gen regulador de la síntesis y resistencia de la estreptomicina; asimismo, activa la expresión de otros miembros de adpA requeridos para la diferenciación morfológica (Bibb, 2005). Su expresión es dependiente de uno o varios factores pleiotrópicos los cuales a su vez, se activan o reprimen en respuesta a diferentes estímulos fisiológicos o ambientales como el choque térmico, las radiaciones, concentraciones de oxígeno demasiado altas o bajas y la acidificación del medio (Bibb, 2005).

La mayor parte de los sistemas de butirolactonas estudiados operan específicamente, de manera que regulan la síntesis de un antibiótico. Un vasto número de receptores de butirolactonas se encuentran localizados en el clúster del antibiótico según la biosíntesis que regulan, por lo tanto, también se les puede considerar como reguladores específicos de ruta (Bibb, 2005).

C.    Reguladores específicos de ruta
Las proteínas de unión al ADN con un peso molecular bajo son llamados reguladores específicos, los cuales actúan como activadores dando lugar a la expresión genética. Muchas de las proteínas reguladoras específicas de rutas metabólicas que controlan el metabolismo secundario en Streptomyces, pertenecen a la familia de tipo SARP (Streptomyces Antibiotic Regulatory Proteins). Estos activadores transcripcionales contienen junto a sus dominios de unión al ADN (hélice-vuelta-hélice), un dominio BTAD (Bacterial transcriptional activator domain). Los SARP se unen con el ADN en las proximidades de su extremo N-terminal (Bibb, 2005).

Algunos ejemplos de estos reguladores son los que codifican el regulador de la actinorrodina actII-ORF4, la undecilprodigiosina RedD y RedZ, la síntesis de la cefamicina C y el ácido clavulánico en S. clavuligerus o el antibiótico dependiente de calcio CDA CdaR en S. coelicolor, por mencionar algunos. Esta familia se ha identificado en diferentes agrupaciones génicas como en la biosíntesis de policétidos aromáticos, péptidos ribosomales y no ribosomales, policétidos Tipo I, β-lactamas y compuestos azoxi (Bibb, 2005).

Activación de operones para la producción de nuevos antibióticos
La secuenciación de genomas de Streptomyces ha proporcionado información acerca de los clústeres de genes encargados de la biosíntesis de metabolitos secundarios. Se ha encontrado que cepas como S. coelicolor, S. avermitilis y S. griseus cuentan con 20 o más clústeres de genes que codifican para enzimas encargadas de la síntesis de metabolitos secundarios, de los cuales, sólo una fracción son expresados durante fermentación (Tanaka y col., 2013; Ochi y Hosaka, 2013). Los métodos utilizados para activar este tipo de genes silenciosos han sido de gran importancia para el descubrimiento de nuevos fármacos (Ochi y Hosaka, 2013) mediante el incremento del potencial biosintético de estos microorganismos productores (Liu y col., 2013).

Además, el desarrollo de nuevas tecnologías como la secuenciación del ADN de siguiente generación, transcriptoma, proteómica, metabolómica y perfiles metabólicos, ha creado nuevas oportunidades en la ingeniería de microorganismos para la elaboración de productos naturales (Olano y col., 2008).

Como lo menciona Olano y col. (2008), las características de los enfoques génicos generales para la producción de un metabolito de interés en actinomicetos, se centran en diferentes aspectos como lo son: a) alteración de la distribución del flujo metabólico de sus diferentes precursores, b) modificación de la regulación de su ruta biosintética, c) inducción de la resistencia a diversos antibióticos, d) sobreexpresión de genes estructurales que codifican para las enzimas implicadas en la biosíntesis del metabolito y  e) expresión de los genes implicados en la biosíntesis en un huésped heterólogo.

Los métodos para activar las rutas biosintéticas silenciosas del metabolismo secundario, tienen como objetivo encontrar la manera para inducir o aumentar la expresión de vías metabólicas débiles y silenciosas. Dentro de los métodos y estrategias utilizadas para identificar y activar las rutas silenciosas se incluyen: la manipulación de las condiciones de fermentación, minería genómica, manipulación genética de los genes reguladores, regulación de moléculas de señalización (Liu y col., 2013), ingeniería ribosómica (Tanaka y col., 2013; Liu y col., 2013; Ochi y Hosaka, 2013) y co-cultivos, (Ochi y Hosaka, 2013). En los siguientes temas, se describen algunas de estas estrategias.

Ingeniería ribosómica
Los grupos de genes para la biosíntesis de antibióticos comúnmente incluyen uno o más genes codificantes a mecanismos de resistencia, para la propia protección de la célula a los efectos tóxicos de sus productos. Estos mecanismos incluyen enzimas que modifican el sitio de destino del antibiótico así como enzimas inactivadoras de antibiótico y sus sistemas de transporte. Los sistemas de resistencia no solo se involucran en la autoprotección del microorganismo sino también en la biosíntesis de antibióticos (Olano y col., 2008). Es por ello que la ingeniería ribosómica es uno de los métodos utilizados para incrementar la producción de antibióticos en bacterias mediante la modulación de los componentes ribosomales como proteínas ribosomales o ARNr, por medio de la introducción de mutaciones que añaden resistencia a los antibióticos (Olano y col., 2008; Tanaka y col., 2013).

La capacidad para detectar mutaciones de resistencia a drogas aunque haya sido muy baja, por simple selección en las placas que contienen el medicamento y la capacidad de seleccionar las mutaciones sin información previa, son algunas ventajas de la ingeniería ribosómica (Tanaka y col., 2013).

Además de incrementar la producción de antibióticos como se mencionó anteriormente, se ha encontrado que mutaciones en el gen rpoB que codifica la subunidad β de la ARN polimerasa y mutaciones en el gen rpsL que codifica para la proteína S12, son efectivas para la activación de genes silenciosos para el metabolismo secundario y por ende, el descubrimiento de nuevos antibióticos (Tanaka y col., 2013; Ochi y Hosaka, 2013). En actinomicetos, se ha demostrado por medio de análisis de perfiles metabólicos que la mutación de rpoB produce varios metabolitos que no son detectados en las cepas de tipo silvestre. Por lo tanto, se puede afirmar que este tipo de mutaciones son ampliamente efectivas para incrementar la producción de antibióticos y activar aquellos clústeres de genes que son silenciosos o pobremente expresados en Streptomyces (Tanaka y col., 2013).

A.    Mutación del gen rpsL para incrementar la producción de antibiótico
Se observó que en S. lividans y S. coelicolor con una mutación en el gen rpsL encargada de codificar la proteína ribosomal S12 que confiere resistencia a estreptomicina, se producía una fuerte activación de la producción de antibiótico. Esto trajo como consecuencia el incremento de la producción de actinorrodina y undecil prodigiosina mediante la introducción de mutaciones puntuales en el cromosoma del gen rspL o el uso de plásmidos para expresar esta mutante. Gracias a ello, la ingeniería ribosómica ha sido utilizada para mejorar e incrementar la producción de antibióticos en diferentes Streptomyces confiriéndoles resistencia a antibióticos mediante mutaciones ribosomales (Olano y col., 2008).

Además del uso de mutantes resistentes a la estreptomicina, mutaciones que otorgan resistencia a otros antibióticos (gentamicina, paromomicina, rifampicin, geneticina, tioestreptona, y lincomicina) también pueden ser usadas para incrementar la producción de antibióticos. Mutaciones simultáneas de resistencia a estreptomicina, gentamicina y rifampicin, producen un incremento en la producción de actinorrodina (en S. coelicolor), salinomicina (en S. albus) y péptido tiazolilo GE2270 (en Planobispora rosea). Este tipo de mutaciones, producen ribosomas con proteínas truncas y actividades de síntesis de nucleótidos hiperfosforilados de guanosina (ppGpp), desencadenando la biosíntesis de antibióticos (Olano y col., 2008).

B.    Mutaciones en el gen rpoB para activación de genes silenciosos
Las mutaciones en rpoB (Figura 3) son ampliamente efectivas no sólo para mejorar la producción del antibiótico (Cuadro 2), sino también para activar los genes silenciosos a nivel transcripcional y metabólico en varios actinomicetos (Tanaka y col., 2013).

Pruebas realizadas en S. mauvecolor demostraron que para los mutantes rpoB H437D y H437L, la activación de genes silenciosos producía una familia de nuevos antibióticos; las piperidamycins (Tanaka y col., 2013; Ochi y Hosaka, 2013). Este mecanismo de activación también se atribuyó a cepas como S. griseus, S. coelicolor y S. erythraea que presentaron activación de genes crípticos o silenciosos y en los genes pobremente expresados por mutación en rpoB. Para este caso, parte de la activación fue relacionada con un aumento de la afinidad del ARN polimerasa mutada hacia los promotores de genes silenciosos (Tanaka y col., 2013).

Para conocer el espectro de activación de cepas mutadas, como es el caso de H437Y y H437R, se debe dejar crecer las cepas en diferentes medios, ya que la activación de clúster de genes silenciosos a partir de mutaciones en rpoB dependen del medio en que se encuentre la cepa mutada, pues la expresión de cada gen silencioso es controlado por diversos factores que son afectados bajo distintas condiciones de cultivo (Tanaka y col., 2013; Ochi y Hosaka, 2013).

Otro de los descubrimientos encontrados gracias a estas mutaciones ha sido un nuevo compuesto relacionado a la actinorrodina en el mutante S. coelicolor rpoB. La estructura propuesta de este compuesto se encuentra relacionada con la ε-actinorrodina pues presentan semejanzas en el tamaño molecular. Cabe señalar que ambos compuestos, son los principales metabolitos generados en el mutante, lo cual posiblemente reflejen una relación en su biosíntesis (Tanaka y col., 2013).

Cuadro 2. Resumen de las mutaciones rpoB efectivas para la sobreproducción de antibiótico.

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Modificado de Tanaka y col. (2013).

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Figura 3. Esquema del procedimiento para generar mutantes rpoB. (Tanaka y col., 2013).

 

Sistema dasR-N-acetilglucosamina
La regulación del sistema dasR-N-acetilglucosamina está implicada en la activación de las rutas de metabolitos secundarios. En Streptomyces, dasR es un regulador de biosíntesis de antibióticos que relaciona las limitantes de nutrientes para producir estos metabolitos. Por otro lado, se sabe que altas concentraciones del monosacárido N-acetilglucosamina (GlcNAc) pueden ser un punto de control para activar el metabolismo secundario de la célula ya que, su acumulación después de la degradación autolítica del micelio vegetativo se transmite como un activador de ruta especifica de antibiótico por medio del represor transcripcional DasR (Ochi y Hosaka, 2013).

En S. coelicolor concentraciones altas de GlcNAc (~10 nM), bloquean la producción de antibiótico en medios de cultivo con condiciones nutrimentales óptimas. Por el contrario, la producción de metabolitos secundarios se ve aumentado en condiciones de escasez de nutrientes, lo cual sugiere que los efectos del GlcNAc dependen en gran medida de las condiciones específicas del cultivo. Otras de las cepas que también pueden ser estimuladas bajo esta regulación son S. clavuligerus, Streptomyces collinus, S. griseus, S. hygroscopicus y S. venezuelae (Ochi y Hosaka, 2013).

La regulación de GlcNAc es controlada por el regulador DasR GntR; sin embargo, glucosamina-6-fosfato inhibe su unión con el ADN. Por ello, la inducción de mutaciones en dasR incrementa la producción de antibióticos. En S. coelicolor mutante dasR BAP29 se incrementó la producción de antibióticos pigmentados, pues DasR reprime la transcripción del gen act II-ORF4 que regula la síntesis de la actinorrodina. Asimismo, se encontró que en el mutante BAP29 se activaron clústeres de genes crípticos encargados de codificar un antibiótico hipotético hecho por un policétido sintasa Tipo I modular (Ochi y Hosaka, 2013).

Otras estrategias
A.    Compuestos remodeladores de antibióticos (CRA)
La activación de genes no sólo se puede dar a nivel transcripcional, sino también mediante la alteración y modificación de las rutas biosintéticas. La ingeniería metabólica se basa en el suministro de precursores con habilidad de incrementar la capacidad de la célula y así producir metabolitos secundarios. La modulación de la biosíntesis de ácidos grasos mediante el uso de moléculas pequeñas, es uno de los métodos utilizados para incrementar la producción de metabolitos secundarios, tal es el caso de S. coelicolor donde se han identificado 19 compuestos que elevan los rendimientos de actinorrodina significativamente. Los estudios realizados en cuatro de esas 19 moléculas, compuestos remodeladores de antibióticos (CRA; ARC, por su siglas inglés) 2, 3, 4 y 5 mostraron que a bajas concentraciones de CRA2 hay un incremento de actinorrodina. Los efectos de CRA2 también influyen en otros actinomicetos. CRA2 inhibe la actividad enoil reductasa de FabI, quien cataliza la etapa final en la biosíntesis de ácidos grasos. Como la síntesis de ácidos grasos y policétidos comparten la acetil-CoA y malonil-CoA como precursores, la inhibición parcial de la síntesis de los ácidos grasos le dará preferencia a la biosíntesis de policétidos de utilizar dichos precursores (Ochi y Hosaka, 2013). Además de su capacidad de incrementar la producción de los antibióticos ya conocidos, las moléculas CRA2 también inducen la producción de compuestos aún no identificados en Streptomyces peuceticus. Esta estrategia se puede implementar para otra clase de antibióticos como aminoglucósidos y péptidos no ribosomales (Ochi y Hosaka, 2013).

B.    Tierras raras
Se ha demostrado que la adición de elementos de tierras raras al medio de fermentación trae como consecuencia una sobreproducción de antibióticos o enzimas en Streptomyces (Tanaka y col., 2013; Liu y col., 2013). Ya que los elementos de tierras raras se encuentran distribuidos ampliamente en el suelo, es posible que los microorganismos hayan adquirido la habilidad para responder a niveles bajos de esos elementos a lo largo de la evolución, como un manera de adaptar su fisiología para prevalecer bajo esas condiciones (Tanaka y col., 2013).

El escandio (10–100 µM), ejerce un efecto a nivel de la transcripción de vías específicas reguladoras. Esto se demostró en el incremento de la regulación de actIIORF4 en S. coelicolor y en la activación de genes biosintéticos de metabolitos secundarios silenciosos o aquellos pobremente expresados (Kawai y col., 2007; Tanaka y col., 2013). Otro de los estímulos significativos fue en la producción de actinomicina en S. antibioticus y estreptomicina en S. griseus (Liu y col., 2013).

C.    Co-cultivos con organismos en común
En algunos casos, señales específicas del ambiente o componentes nutricionales son requeridos para la activación de genes silenciosos. Por ello, los co-cultivos han sido un método efectivo para la activación de metabolitos crípticos ya que refleja la interacción de microorganismos en el medio ambiente (Liu y col., 2013).

Bacterias que contienen ácido micólico pueden influenciar la biosíntesis de productos, que naturalmente están crípticos o silenciosos en Streptomyces. Un ejemplo de ello, es el co-cultivo de cepas de Streptomyces con Tsukamurella pulmonis, quienes inducen a Streptomyces a producir nuevos antibióticos (Liu y col., 2013; Ochi y Hosaka, 2013). Las interacciones con T. pulmonis incrementan o inhiben la biosíntesis de productos naturales en un 88% de las cepas de Streptomyces; la producción de nuevos metabolitos secundarios fue detectada en un 37% de las cepas mientras que un incremento en la producción de metabolitos fue de 55%. Gracias a la interacción entre T. pulmonis con Streptomyces endus, se condujo a la identificación del alchivemycin A. Por otro lado, la interacción entre bacterias Rhodococcus erythropolis y Corynebacterum glutamicum con Streptomyces, generaron una producción de nuevos metabolitos secundarios detectados en 32 y 24% de las cepas, respectivamente (Ochi y Hosaka, 2013).

Cabe señalar que la adición de ácido micólico al medio no tiene efecto en la producción de antibióticos, es la interacción entre ambas bacterias lo que afecta el metabolismo secundario del Streptomyces y que se ve reflejado en la producción de metabolitos. Este método puede ser escalable para inducir la producción de antibióticos crípticos solo con la adición de bacterias que contienen ácido micólico a un cultivo de actinomicetos (Ochi y Hosaka, 2013).

CONCLUSIÓN
Los avances científicos y tecnológicos que se han desarrollado a través de los años, han generado grandes beneficios para el hombre en distintas áreas de aplicación. Con las investigaciones realizadas en campos como la genética y biotecnología, se ha logrado comprender la estructura, metabolismo, regulación génica, modo de replicación y funciones vitales de una gran variedad de organismos. Debido a estos conocimientos, se han podido implementar estrategias para la manipulación de los organismos y su metabolismo y de esta manera, obtener productos naturales de gran interés, como es el caso de nuevos antibióticos.

La manipulación de rutas metabólicas específicas, moléculas reguladoras, genes del metabolismo secundario y de componentes estructurales celulares, por mencionar algunas, son estrategias utilizadas para activar genes silenciosos implicados en la síntesis de metabolitos secundarios en estreptomicetos. Estas modificaciones concebidas tanto a nivel transcripcional como metabólico, han generado no sólo el incremento de la producción de antibióticos como la actinorrodina, estreptomicina y actinomicina, sino que también han llevado al descubrimiento de nuevos antibióticos que no son expresados en condiciones estándares de fermentación como es el caso de antibióticos de la familia piperidamycin y compuestos relacionados con la actinorrodina.

Sin duda alguna, la implementación de estas estrategias ha conllevado al descubrimiento de compuestos de gran interés, por lo cual, es imperativo que el uso de manipulaciones como las mencionadas anteriormente continúen y sigan innovándose, ajustándose a las necesidades actuales de la humanidad y que no solo se queden establecidas para microorganismos específicos como el caso de actinomicetos, sino que en un futuro puedan ser implementados para otra clase de organismos.

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2 thoughts on “Activación de Genes Silenciosos Productores de Metabolitos Secundarios en Streptomyces, para la Obtención de Nuevos Antibióticos

  1. Alejandro Rodarte says:

    Me interesa en pdf, ¿Cómo podría obtenerlo?

    Responder
    • aqm says:

      Hola, una disculpa por la tardanza en contestar, se lo enviamremos a su correo.

      saludos!!

      Responder

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